三級甲等綜合醫(yī)院國營
北京協(xié)和醫(yī)院是集醫(yī)療、教學(xué)、科研于一體的現(xiàn)代化綜合三級甲等醫(yī)院,是國家衛(wèi)生健康委指定的全國疑難重癥診治指導(dǎo)中心,最早承擔(dān)高干保健和外賓醫(yī)療任務(wù)的醫(yī)院之一,也是高等醫(yī)學(xué)教育和住院醫(yī)師規(guī)范化培訓(xùn)國家 級
取材:血液
血氨的測定原理:血漿氨的酶法測定基于下列反應(yīng):
在過量α-酮戊二酸、NAD(P)H和足量谷氨酸脫氫脫氫酶(GLDH)條件下,酶促反應(yīng)的速率,即NAD(P)H轉(zhuǎn)變成NAD(P)+使340nm吸光度的下降速率與反應(yīng)體系中氨的濃度呈正比關(guān)系。
試劑:全部試劑必須用去氨水制備。去氨水用蒸餾水經(jīng)氫型陽離子交換樹脂處理獲得。
(1)66.7mmol/LKH2PO4溶液:取9.12gKH2PO4溶入去氨水中,定溶到1L,4℃保存。
(2)66.7mmol/LNa2HPO4溶液:取9.51gNa2HPO4溶解并加去氨水到1L,4℃保存。
(3)pH8.0(±0.05),66.7mmol/L磷酸鹽緩沖液(PB):取5ml“1”液及95ml“2”液,混合,4℃保存,穩(wěn)定3周。
(4)310mmol/Lα-酮戊二酸:取0.45gα-酮戊二酸,溶于5ml去氨水中,用3mol/L氫氧化鈉調(diào)pH至接近5.0時(shí),改用0.1mol/L氫氧化鈉調(diào)pH至6.8(±0.01),切勿調(diào)得過堿,因高pH可破壞α-酮戊二酸,以去氨水稀釋到10ml,4℃穩(wěn)定10天;
(5)NADPH貯存液:稱約10mgN-ADPH(-20℃、干燥器保存)溶于1mlPB中取出50μl,以PB稀釋到5ml為工作液,以PB調(diào)零,1cm光徑,在340nm波長讀NADPH工作液的吸光度,計(jì)算NADPH貯存液中實(shí)際濃度:
6.22為NADPH的毫摩爾吸光系數(shù),據(jù)上式計(jì)算結(jié)果確定制備GLDH工作液中加入NADPH貯存液的量,使達(dá)到149μmol/L。
(6)GLDH工作液:根據(jù)GLDH酶制品(-20℃干燥器中保存)的比活,稱出酶活力為992U的相應(yīng)量(如比活為50U/mg蛋白,則稱20mg),如GLDH在甘油中,可按U/ml吸出992U的相應(yīng)體積,置50ml量瓶中,稱入ADP(-20℃,干燥器中保存)15mg,吸入計(jì)算量的NADPH貯存液,以PB稀釋到50ml,4℃保存可穩(wěn)定7天;
(7)氨標(biāo)準(zhǔn)貯存液,100mmol/L:稱取(NH4)2SO4660.7mg,溶于去氨水定容到100ml,4℃保存;
(8)氨標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液:用去氨水分別稀釋貯存液成25、50、100、及150μmol/L。
操作方法:所用分光光度計(jì)需配有37℃恒溫比色系統(tǒng)及340nm波長。如用自動分析儀,可根據(jù)本法反應(yīng)條件自行設(shè)計(jì),樣品及試劑用量按比例減少。操作見表1,按B、S、U管先后順序進(jìn)行。
混勻,于10s時(shí)讀A10s于70s時(shí)讀A70s,求各管的△A,即△A=A10s-A70s。
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