三級甲等綜合醫(yī)院國營
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1.樣本處理
a.組織勻漿:稱取100~200mg新鮮組織如肝臟、腦、心肌等,PBS或生理鹽水沖洗,洗凈血水,濾紙吸干,用剪刀剪為碎塊放入小容量玻璃勻漿器內(nèi)。加入1.0mL預(yù)冷的LysisBuffer,再加入50ulReagentA,0℃冰浴中上下研磨組織20次;有未研磨開的組織,可用雙層紗布過濾。
b.培養(yǎng)細(xì)胞勻漿:消化細(xì)胞,PBS洗滌,800×g5~10min離心收集細(xì)胞。計數(shù)。每次提取需要5×107個細(xì)胞,加入1.0mL冰預(yù)冷的LysisBuffer重懸細(xì)胞,再加入50ulReagentA,將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到小容量玻璃勻漿器內(nèi),0℃冰浴研磨細(xì)胞20~30次。
2.將組織或細(xì)胞勻漿物轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中,4℃,700×g離心5min。細(xì)胞核沉淀在收集管底部,棄上清。加入0.5mL冰預(yù)冷的LysisBuffer重懸沉淀;
3.取另一新離心管內(nèi)加入0.5mLMediumBuffer,吸取上一步的重懸液,沿管壁小心地加入到此離心管中,置于MediumBuffer之上,4℃,700×g離心5min。將上清轉(zhuǎn)移到新離心管,細(xì)胞核沉淀在管底;
5.棄上清,在細(xì)胞核沉淀中加入0.5mLLysisBuffer重懸細(xì)胞核沉,1000×g離心10min,棄上清,得較純的細(xì)胞核沉淀;
6.用50-100μLStoreBuffer或合適的反應(yīng)緩沖液重懸細(xì)胞核沉淀,立即使用或-70℃保存。
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