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厭氧菌的分離與鑒定

基本信息

  • 專科分類: 生長發(fā)育檢查
  • 檢查分類: 生化檢查
  • 適用性別: 男女均適用
  • 是否空腹:  空腹
  • 手術參考價: 35元
  • 科 室: 生長發(fā)育檢查

厭氧菌的分離與鑒定檢查簡介

厭氧菌的分離與鑒定是對氧敏感度高的細菌進行分離與鑒別的試驗,因為厭氧微生物在自然界分布廣泛,種類繁多,其生理作用日益受到人們的重視。專性厭氧菌,對氧氣非常敏感,因此,他們的分離、培養(yǎng)及活菌計數(shù)的關鍵是提供無氧和低氧化還原電勢的培養(yǎng)環(huán)境。

厭氧菌的分離與鑒定檢查過程

分離

(1)編號

取五支無菌水試管,分別用記號筆標明10-1、10-2……10-5。

(2)稀釋

在無氧無菌的超凈厭氧手套箱中的條件下,用無菌注射器吸取1mL混合均勻的液體樣品,加入裝有預還原生理鹽水的厭氧試管中,用震蕩器將其混合均勻,制成10-1稀釋液。用無菌注射器吸取1mL10-1稀釋液至另一裝有9mL生理鹽水的厭氧試管中,制成10-2稀釋液。依此進行10倍系列稀釋,至10-6,制成不同樣品稀釋液。通常選10-4、10-5、10-6三個稀釋度進行滾管計數(shù)。

(3)滾管分離

1)滾管

將無氧無菌的瓊脂培養(yǎng)基在沸水浴中溶化,置46-50℃恒溫的水浴中,待用,當培養(yǎng)基從瓶中取出時,要用N2在培養(yǎng)基內中充氣。再在試管中用N2充氣,趕走所有管內空氣,然后把培養(yǎng)基加入管內,立即塞上瓶塞。待瓶塞塞入管內,及時拔出充氣針頭。用無菌注射器吸取10-4、10-5、10-6三個稀釋度各0.1mL,分別注入待用的試管中,然后將其平放于盛有冰水的瓷盤中迅速滾動,帶菌的溶化瓊脂在試管內壁會即刻形成凝固層。

2)分離純化

生成的菌落需挑取出來,鏡檢其形態(tài)及純度。如尚未獲得純培養(yǎng)物,需再次稀釋滾管,并再次挑取菌落,直至獲得純培養(yǎng)物為止。待挑取的單菌落預先在放大鏡下觀察確定,做好標記。然后將培養(yǎng)基試管固定于適當?shù)闹Ъ苌希蜷_試管膠塞,同時迅速將氣流適當、火焰滅過菌的氮氣長針頭插入管內。同時,另一液體厭氧管去掉膠塞插入另一滅過菌的通氣針頭。將準備好的彎頭毛細管小心插入固體培養(yǎng)基內,找準待挑菌落,輕輕吸取,轉移至液體試管內,加塞。37℃培養(yǎng),培養(yǎng)24h或更長時間或待培養(yǎng)液混濁后檢查已分離培養(yǎng)物的純度。

3)劃線分離

將試管橡皮塞的一端在火焰上灼燒一下,挨著打氣針塞住管口,在針頭快速取下前,通氣15-20s,管口一端在火焰上燒片刻。旋緊管塞,劃線后的卷管直立保溫,使用CO2:H2=80:20,因為CO2比空氣重,開啟后管塞不致有空氣殘留。劃線后的滾管,置34-37度下培養(yǎng),便可長出菌落。

菌種的鑒定

1糖發(fā)酵試驗

糖發(fā)酵實驗是最常用的生化反應,在腸道細菌鑒定上尤為重要。絕大多數(shù)細菌都能利用糖類作為碳源和能源,但是它們在分解糖的能力上有很大差異,有些細菌能分解糖并產酸(如乳酸、醋酸、丙酸等)和氣體(如氫、甲烷、二氧化碳等);有些細菌只產酸不產氣。例如大腸桿菌能分解乳糖和葡萄糖產酸并產氣;傷寒桿菌能分解葡萄糖產酸不產氣,不能分解乳糖;普通變形桿菌分解葡萄糖產酸產氣,不能分解乳糖。酸的產生可以利用指示劑來斷定。在配制培養(yǎng)基時預先加入溴甲酚紫[pH5.2(黃色)—6.8(紫色)],當發(fā)酵產酸時,可使培養(yǎng)基由紫色變?yōu)辄S色。氣體的產生可由發(fā)酵管中倒置的德漢氏小管中有無氣泡來證明。

具體實驗步驟:

①將菌液進行適當稀釋,之后在無菌環(huán)境下,取一定量的稀釋液注入生化鑒定管中,用無菌封口膜封口。

②將接種后的鑒定管放入厭氧罐中,充足氮氣后放入37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

③24h后觀察各管中液體顏色變化及產氣情況。

2蛋白質分解實驗

①將菌液進行適當稀釋,之后在無菌環(huán)境下,取一定量的稀釋液注入生化鑒定管中,用無菌封口膜封口。

②將接種后的鑒定管放入厭氧罐中,充足氮氣后放入37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

③24h后各管分別進行米倫氏反應、吲哚反應、黃色反應和坂口反應等。

3淀粉水解實驗

①將菌液進行適當稀釋,之后在無菌環(huán)境下,取一定量的稀釋液注入生化鑒定管中,用無菌封口膜封口。

②將接種后的鑒定管放入厭氧罐中,充足氮氣后放入37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

③24h后于各管中加入適量盧戈氏碘液觀察淀粉的水解情況。

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